我們的策略是直接在功能上研究，通過(guò)gRNA敲除候選基因篩選得到功能基因。合成致死的靶基因，gRNA和藥物聯(lián)合使用可以篩選到能夠起耐藥作用的靶基因。這些數(shù)據(jù)為靶向治療和聯(lián)合用藥提供了重要依據(jù)?；趃RNA文庫(kù)的高通量篩選，可平行分析成千上萬(wàn)條基因功能，大大加快研究進(jìn)程，從而能迅速、詳盡地鑒定出細(xì)胞過(guò)程或信號(hào)傳導(dǎo)途徑的相關(guān)基因，以及疾病相關(guān)的藥物靶基因，保證研究成果更為系統(tǒng)和新穎。

基于慢病毒策略的單細(xì)胞篩選技術(shù)

1.  oligo用芯片方式合成，成本遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)化學(xué)方式。

2.  gRNA片段構(gòu)建到慢病毒載體上，包裝成慢病毒混合文庫(kù)。

3.  通過(guò)控制病毒用量，盡量讓每個(gè)細(xì)胞被一個(gè)基因的一個(gè)靶點(diǎn)所作用。

4.  利用控制細(xì)胞存活，結(jié)合免疫染色、流式細(xì)胞術(shù)等手段得到篩選后的細(xì)胞。

5.  篩選得到的細(xì)胞使用通用引物PCR，二代測(cè)序分析，通過(guò)比對(duì)得到gRNA信息，從而推斷出起作用的靶基因。

成功案例

 已知藥物功能篩選其耐藥靶點(diǎn)

篩選策略：

1.   明確該藥物功能，明確該藥物的致死工作濃度。

2.  構(gòu)建Cas9-gRNA慢病毒文庫(kù)。侵染細(xì)胞，構(gòu)建整合Cas9-gRNA的細(xì)胞混合克隆。

3.  開(kāi)展篩選工作：高濃度藥物短期內(nèi)持續(xù)作用細(xì)胞混合克隆，成活的細(xì)胞即為產(chǎn)生耐藥性的細(xì)胞，而產(chǎn)生耐藥性的原因是Cas9-gRNA導(dǎo)致的基因變異。

4.  存活的細(xì)胞通過(guò)二代測(cè)序，比對(duì)得到gRNA信息，從而推斷出起作用的基因靶點(diǎn)

成品文庫(kù)信息：

1.  人源CRISPR/Cas9-sgRNA慢病毒文庫(kù)：約21000個(gè)基因，每個(gè)基因?qū)?yīng)6條gRNA。

慢病毒毒液，-80度儲(chǔ)存。

詢(xún)價(jià)。

參考文獻(xiàn)：

1.  ShalemO , Sanjana N E , Hartenian E , et al.Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells[J]. Science, 2014,343(6166):84-87.